南方醫(yī)科大學(xué)研究團隊成果：人參皂苷Rg1通過調(diào)節(jié)腸道菌群、色氨酸代謝和血清素能系統(tǒng)功能減輕嗎啡依賴
研究背景
嗎啡依賴是一種毀滅性的神經(jīng)精神疾病，可能與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)。人參皂苷Rg1(Rg1)是從人參根中提取的活性成分，對神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在的保健作用。然而，它在物質(zhì)使用障礙中的作用仍不清楚。該文探索了Rg1在對抗嗎啡依賴中的潛在調(diào)節(jié)作用。
研究結(jié)果
1.人參皂甙 Rg1 抑制嗎啡誘導(dǎo)的小鼠的條件位置偏好（CPP）
調(diào)理訓(xùn)練后各組小鼠體重略有增加，但是未觀察到顯著差異。使用Smart3.0軟件在15分鐘內(nèi)跟蹤小鼠頭部并記錄它們的軌跡和停留時間。對照組和其他組之間的軌跡或CPP分?jǐn)?shù)沒有顯著差異。在嗎啡注射后在白室中花費的時間與基線相比以及在鹽水處理后在白室中花費的時間顯著增加，表明嗎啡成功誘導(dǎo)CPP在實驗小鼠中。MRH和MRL組與模型組相比，MRL和MRH小鼠在藥物配對隔室的停留時間和軌跡顯著減少。然而，在單獨用人參皂甙Rg1治療的小鼠中，沒有觀察到CPP評分和活動途徑的變化。
2.人參皂甙Rg1改善CPP小鼠腸道菌群失調(diào)
阿片類藥物成癮通常與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。為了進一步探索Rg1介導(dǎo)的抗成癮機制，對糞便進行了16S rRNA 基因擴增子測序，以評估有或沒有Rg1處理的CPP小鼠腸道微生物群的組成。維恩圖顯示了對照組和其他組小鼠共有476個OTU。然而，對照組有1108個OTU，M組有1304個，MM組有19個，MRL組有548個，MRH組有1702個，CR組有195個。這些數(shù)據(jù)暗示了嗎啡治療誘導(dǎo)的腸道微生物群紊亂和人參皂苷Rg1給藥后的部分恢復(fù)。值得注意的是，使用Chao1指數(shù)進行的α多樣性分析顯示，Rg1阻止了嗎啡引起的細(xì)菌豐富度下降；然而，各組之間的香農(nóng)指數(shù)沒有差異。通過Bray-Curtis主坐標(biāo)分析(PCoA)研究腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)表明，嗎啡組的細(xì)菌組成發(fā)生了變化，與對照組不同，表明腸道菌群失調(diào)嗎啡處理誘導(dǎo)了微生物群。然而，MRL、MRH、MM和CR組顯示了四種不同的細(xì)菌組成簇。值得注意的是，MRL中的微生物群與MRH組中的微生物群更緊密地聚集在一起。我們在門水平上進一步分析了每組的腸道細(xì)菌組成。人參皂甙Rg1顯著增加嗎啡誘導(dǎo)的擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度的降低，并顯著降低嗎啡誘導(dǎo)的藍藻和變形桿菌的相對豐度增加。在家族水平上的進一步分析顯示，嗎啡處理導(dǎo)致隨著葉綠體和線粒體的增加，擬桿菌屬、Sutterellaceae和Tannerellaceae的相對豐度急劇下降。在MRL和MRH組中，嗎啡誘導(dǎo)的豐度變化不同程度地逆轉(zhuǎn)。此外，Kruskal-WallisH檢驗用于評估指定組之間在物種水平上的差異的顯著性，并觀察到15個優(yōu)勢物種?？紤]到報告顯示嗎啡依賴模型中擬桿菌屬的豐度低于對照，我們專注于擬桿菌屬物種B.vulgatus、B.xylanisolvens和B.acidifaciens。嗎啡顯著降低了B.acidifaciens、B.vulgatus和B.xylanisolvens 的豐度。值得注意的是，B.vulgatus的相對豐度在Rg1給藥后顯著增加。除了16SrRNA 測序外，我們還用B.vulgatus特異性引物進行了定量PCR，證實嗎啡顯著降低了豐度，人參皂苷Rg1處理后豐度顯著增加。
3.人參皂甙 Rg1抑制腸道微生物群衍生的水平和CPP小鼠血清色氨酸代謝物
在藥物依賴期間，腸道代謝譜發(fā)生變化，宿主代謝途徑可能發(fā)生改變。我們假設(shè)人參皂苷Rg1可能通過腸道微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物影響CPP。基于這一理論，我們使用非靶向代謝組學(xué)來識別可能在小鼠血清和腸道中改變的關(guān)鍵代謝物和代謝途徑。MRL組和MRH組對嗎啡誘導(dǎo)的CPP的療效沒有觀察到統(tǒng)計學(xué)差異；然而，行為分析數(shù)據(jù)顯示，MRH組的療效優(yōu)于MRL組。因此，我們選擇MRH組作為非靶向代謝組學(xué)分析的代表性藥物干預(yù)組。在血清和糞便中分別鑒定出1955和559種代謝物。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型分別在血清和糞便中的CONTROL、MODEL和MRH組中顯示出顯著的聚類分離。熱圖分析顯示，CPP導(dǎo)致代謝物發(fā)生顯著變化，小鼠糞便和血清中共有177種代謝物（96種上調(diào)和81種下調(diào)）和69種代謝物（44種上調(diào)和25種下調(diào)）分別顯著改變。此外，對代謝物途徑的分析表明，與對照組相比，CPP小鼠的以下途徑發(fā)生了顯著變化：色氨酸、α-亞麻酸、甘油磷脂、精氨酸和脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝。值得注意的是，色氨酸代謝受到糞便和血清中嗎啡的顯著影響。將MRH與MODEL組進行比較，在人參皂苷Rg1處理后，糞便和血清中的195種代謝物（94種上調(diào)和101種下調(diào)）和115種代謝物（60種上調(diào)和55種下調(diào)）分別顯著改變。代謝組學(xué)圖顯示色氨酸代謝受到Rg1補充的顯著影響。色氨酸代謝在微生物組-腸-腦軸中起關(guān)鍵作用。在這種情況下，我們專注于色氨酸代謝相關(guān)的代謝物。具體而言，色氨酸代謝相關(guān)代謝物的熱圖分析表明，參與色氨酸代謝的四種主要中間代謝物L(fēng)-色氨酸、吲哚、N'-甲酰基犬尿氨酸和血清素是對嗎啡的反應(yīng)最顯著增加的代謝物，它們的水平在Rg1處理后，糞便或血清中的含量降低。具體來說，我們發(fā)現(xiàn)與模型組相比，Rg1處理的腸道色氨酸和血漿血清素水平下調(diào)。
4.人參皂甙 Rg1 改善 CPP 小鼠海馬 5-羥色胺能系統(tǒng)的變化
血清色氨酸濃度會影響大腦的血清素系統(tǒng)。我們推測宿主色氨酸代謝物的變化可能與CPP小鼠的海馬血清素能系統(tǒng)和其他神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。為了驗證這一假設(shè)，使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測海馬和外周血清中谷氨酸、多巴胺、γ-GABA和5-HT的表達水平。在海馬中，相對于對照組，CPP小鼠表現(xiàn)出顯著升高的多巴胺水平和降低的γ-GABA水平。然而，組間谷氨酸和血清素的濃度沒有差異。與M組相比，MRH組海馬中GABA含量增加。此外，在MRL和MRH小鼠中觀察到多巴胺水平顯著下降。注射嗎啡后血清中血清素和多巴胺水平升高，γ-GABA水平降低。所有CPP誘導(dǎo)的變化都被Rg1處理逆轉(zhuǎn)。為了進一步探索Rg1介導(dǎo)的抗成癮機制，我們使用qPCR檢測了小鼠海馬中獎賞相關(guān)基因mRNA的相對轉(zhuǎn)錄水平，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激酶受體2型(TrkB)和血清素受體。與Rg1治療組的轉(zhuǎn)錄水平相比，嗎啡組中5-羥色胺受體（5-HTR1B和5-HTR2A）、BDNF和TrkB的轉(zhuǎn)錄水平因人參皂苷Rg1給藥而下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明人參皂甙Rg1可能通過抑制血清素系統(tǒng)來改善嗎啡依賴。 5.腸道微生物組的調(diào)控影響人參皂甙 Rg1 對嗎啡誘導(dǎo)的小鼠 CPP 的抑制作用 為了研究腸道菌群失調(diào)對嗎啡誘導(dǎo)的小鼠行為的影響，我們在進行嗎啡依賴性CPP訓(xùn)練之前，給BALB/cSPF 小鼠施用了不可吸收的抗菌劑或無菌水的混合物7天，然后進行CPP測試。ATM治療后各組小鼠體重下降，調(diào)理訓(xùn)練后略有增加；然而，各組之間沒有觀察到差異。ABX與對照組相比，同時給予多種抗生素后，所有抗生素治療小鼠在藥箱中的停留時間均增加。此外，與ABX組相比，AM組在藥物配對隔室中的停留時間明顯增加。令人驚訝的是，小鼠在AMRL、AMRH和AMM組的藥物配對隔室中的停留時間與AM組沒有顯著差異。我們在鼠標(biāo)頭部軌跡中觀察到相同的現(xiàn)象。為了評估抗生素暴露后小鼠腸道微生物群發(fā)生的變化，通過16SrRNA 基因測序測定了糞便細(xì)菌組成?？股刂委煒O大地改變了微生物組并減少了細(xì)菌負(fù)荷。為了研究腸道菌群失調(diào)對嗎啡誘導(dǎo)的小鼠行為的影響，我們使用了維恩圖顯示了對照組和其他抗生素治療小鼠共享的476個OTU；然而，1606個OTU是對照組獨有的，48-68個OTU是其他六個抗生素治療組獨有的。隨后用抗生素混合物治療導(dǎo)致腸道微生物群顯著消耗，細(xì)菌多樣性顯著降低。PCoA顯示抗生素治療的小鼠與對照小鼠相比具有顯著不同的微生物群落。但ABX、AM、AMRL、AMRH、AMM和AR組的細(xì)菌多樣性沒有顯著變化，說明抗生素治療根除大部分共生菌，嗎啡和人參皂苷Rg1治療后沒有顯著變化.我們在ABX小鼠的糞便中發(fā)現(xiàn)了幾種細(xì)菌門，這些細(xì)菌門相對于對照組的糞便發(fā)生了改變。優(yōu)勢門不同，伴隨著Proteobacteria的豐度顯著增加，而Verrucomicrobiota、Cyanobacteria、Firmicutes和Deferribacterota的豐度在抗生素處理后下降。然而，用抗生素治療小鼠并沒有改變擬桿菌的相對豐度，盡管抗生素治療耗盡了腸道微生物組成。最后，我們用B.vulgatus特異性引物進行了定量PCR，并證實與對照組相比，抗生素治療組的細(xì)菌顯著減少了數(shù)百至數(shù)千倍。此外，嗎啡和人參皂甙Rg1并沒有改變B.vulgatus對抗生素的反應(yīng)。 6.腸道微生物組的消耗影響色氨酸代謝并抑制 Rg1 誘導(dǎo)的基因表達 接下來檢測了抗生素混合物治療對嗎啡誘導(dǎo)的CPP小鼠代謝物和代謝途徑的影響。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型顯示，在糞便中的代謝物方面，對照組和ABX組之間的簇顯著分離。值得注意的是，抗生素治療后ABX、AM和AMRH組之間沒有明顯的代謝物聚集。我們專注于色氨酸代謝途徑，并觀察到參與色氨酸代謝的代謝物被ATM顯著改變。然而，在ABX、AM和AMRH中未觀察到顯著變化。因此，這些數(shù)據(jù)表明抗生素治療強烈降低了糞便中色氨酸代謝物的水平，并且由嗎啡和Rg1引起的代謝改變被消除。此外，在血清中，PLS-DA結(jié)果顯示四組（對照組、ABX、AM和AMRH）的代謝物譜不同。ATM顯著改變了色氨酸代謝物。值得注意的是，與 ABX小鼠相比，注射嗎啡的小鼠的代謝物發(fā)生了相當(dāng)大的變化。具體而言，與 AM組相比，色氨酸代謝物在Rg1處理后沒有顯示出顯著變化。我們發(fā)現(xiàn) Rg1治療組和模型組在ABX治療后腸道色氨酸和血漿血清素水平?jīng)]有差異。隨后，我們發(fā)現(xiàn)微生物組消耗抵消了 Rg1在CPP小鼠海馬體中誘導(dǎo)的變化。Rg1治療未能逆轉(zhuǎn)5-HT、多巴胺、5-HTR1B/5-HTR2A 和BDNF-TrkB信號通路。 7.B.vulgatus 協(xié)同增強人參皂苷 Rg1 抑制嗎啡誘導(dǎo)的小鼠 CPP 因為腸道B.vulgatus 減少和增加與嗎啡誘導(dǎo)的CPP增加和Rg1降低CPP一致，并且在抗生素處理的小鼠中消除了人參皂苷Rg1對CPP的改善，我們探討了B.vulgatus 是否在嗎啡中起作用依賴。作為典型的擬桿菌屬物種，普通擬桿菌是小鼠腸道中的主要細(xì)菌物種，我們試圖確定普通擬桿菌是否會影響CPP進展。我們首先使用抗生素治療來消耗腸道微生物群，然后再用B.vulgatus 定植。在嗎啡誘導(dǎo)的CPP小鼠模型中檢查B.vulgatus 對嗎啡成癮的影響?？股刂委熁駼.vulgatus 移植沒有顯著改變體重。單獨使用B.vulgatus (AMBV) 進行灌胃顯著降低了白框中的停留時間和軌跡百分比，而嗎啡則增加了該百分比。值得注意的是，與B.vulgatus 和人參皂苷Rg1(AMBVR)共同治療的小鼠在藥物配對隔室中的停留時間和軌跡百分比顯著降低。這些數(shù)據(jù)清楚地表明AMBVR在抑制CPP方面比AMBV取得了更好的功效。值得注意的是，在我們的研究中，用“嗎啡”微生物組(AMF)進行腸道再定殖并沒有誘導(dǎo)CPP行為。 8.B.vulgatus 可以改變腸道微生物組成 小鼠糞便樣本的16SrRNA 基因測序揭示了用活的B.vulgatus灌胃腸道微生物群組成的變化。擬桿菌門的相對豐度從AM組的不到20%增加到AMBV組的40%和AMBVR組的60%。定量PCR證實，與對照組相比，AMBV和AMBVR組灌胃后腸道中的細(xì)菌顯著過度生長數(shù)百至數(shù)萬倍。這些數(shù)據(jù)表明，人參皂甙Rg1提高了CPP小鼠中普通雙歧桿菌的豐度。 9.B.vulgatus 改變了腸道微生物群衍生和宿主色氨酸代謝物 對小鼠的糞便和血清進行了代謝組學(xué)分析。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)顯示AM、AMBV和AMBVR組之間完全分離。熱圖分析顯示，僅用B.vulgatus灌胃導(dǎo)致CPP小鼠代謝物發(fā)生顯著變化，糞便中有332種代謝物（211種上調(diào)和121種下調(diào)），血清中有82種代謝物（58種上調(diào)和24種下調(diào)）。我們對具有已知KEGGID 的332和82種顯著不同的代謝物進行了KEGG途徑富集分析，并分別鑒定了14和11種富含色氨酸代謝的代謝物。同時，將AMBVR與AM組進行比較，糞便中的313種代謝物（237種上調(diào)和76種下調(diào)）和血清中的82種代謝物（44種上調(diào)和38種下調(diào)）在與普通芽孢桿菌和人參皂甙Rg1共同處理后顯著改變。在糞便中發(fā)現(xiàn)了13種代謝物，血清中發(fā)現(xiàn)了11種代謝物富集到色氨酸代謝，AMBV和AMBVR都改變了腸道微生物群衍生和宿主色氨酸代謝。我們隨后檢查了糞便和血清中由AMBV和AMBVR改變的色氨酸代謝物的相對豐度。用B.vulgatus 灌胃下調(diào)色氨酸和血清素水平。 10.B.vulgatus 協(xié)同增強人參皂甙-Rg1 誘導(dǎo)的嗎啡誘導(dǎo)的海馬 5-羥色胺能變化的抑制作用 最后，為了證實人參皂甙Rg1通過影響腸道微生物群衍生的色氨酸代謝-血清素途徑來減輕嗎啡依賴，我們測定了海馬和血清中5-HT、多巴胺和GABA的水平。CPP小鼠中血清素和多巴胺的血漿濃度較低，而GABA的血漿濃度高于單獨用普通雙歧桿菌灌胃或與Rg1共同治療的小鼠。值得注意的是，AMBVR小鼠的海馬5-HT濃度顯著低于AM小鼠。qPCR進一步證實了血清素受體和BDNF-TrkB的mRNA水平升高。我們觀察到5-HTR1B、5-HTR2A和BDNF-TrkB的表達被B.vulgatus 定植和Rg1處理有效抑制。
研究結(jié)論
該研究表明人參皂苷Rg1對嗎啡依賴的改善作用與腸道微生物群有關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)微生物組的消耗和擬桿菌的補充可以影響嗎啡依賴性并影響Rg1的功效，伴隨著色氨酸代謝和5-羥色胺的變化。該研究結(jié)果提供了一個新的框架來理解中藥通過腸道微生物群-色氨酸代謝和血清素能系統(tǒng)拮抗嗎啡成癮的機制，可能會帶來新的診斷和治療策略。
